Бактериоскопическое исследование окрашенного мазка ( по Граму)

Суть бактериоскопического метода диагностики

Бактериоскопический метод исследования образца предназначен для выявления микроорганизмов в исследуемом веществе, а также для подробного изучения свойств этих микроорганизмов, уточнении их количества и поведения в рассматриваемой среде. Достоинствами этого способа изучения анализов являются простота, быстрота проведения и доступность. Он может быть проведен практически в любой лаборатории с использованием минимального количества инструментов и химических реактивов. К его недостаткам можно отнести невозможность получения полной картины поведения микробов.

Характеристика бактериоскопического метода исследования

Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования — совокупность способов изучения морфологических и тинкториальных (способность окрашиваться) свойств микробов в исследуемом материале (лабораторная культура, патологический материал, пробы из внешней среды) с помощью микроскопии. Основная цель — установление этиологии болезни, морфологическая идентификация, а также определив чистоты выделенной чистой культуры. В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов: а) бактериологический мазок (препарат-мазок); б) «висячая капля»; в) «придавленная капля»; г) тонкий мазок; д)»толстая капля»; ж) препарат-отпечаток.

Этапы метода:

1. Забор материала (гной, мокрота, кровь, моча, испражнения, промывные воды бронхов и желудка, ликвор, содержимое полостей носа, вагины, трупный материал и др.).

2. Транспортировка материала.

3. Приготовление микропрепаратов, фиксация и окраска (при необходимости).

4. Микроскопия с оценкой формы, размеров, взаимного расположения микробов и т.д.

5. Заключение.

Оценка метода: Метод прост, широко доступен, быстр, экономичен, но мало чувствителен

(около 104-105 бактерий в мл) и специфичен (из-за схожести морфологии

микроорганизмов разных видов), небезопасен.

2. Световые микроскопы. Принципы устройства простого, фазовоконтрастного, темнопольного, люминесцентного микроскопов и их применение в микробиологии. Техника иммерсионной микро­скопии.

Размеры микробов, имеющих клеточное строение, составляют 0.2 — 20 мкм (чаще 0,5 — 10 мкм) и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе. Вирусы во много раз меньше. Диаметр самых больших из них, например вируса натуральной оспы, около 300 нм, а у самых мелких составляет 20 — 30 нм. Ввиду этого для выявления вирусов используются электронные микроскопы. В микробиологических исследованиях применяют световые и электронные микроскопы; методы оптической и электронной микроскопии.

Оптический микроскоп. Наиболее важной оптической частью микроскопа являются объективы, которые по способу использования и степени увеличения делятся на сухие и иммерсионные. Сухие объективы с относительно большим фокусными расстоянием и слабым увеличением применяются для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10 — 20 мкм), иммерсионные

с фокусным расстоянием 1,5 — 3 мм — при исследовании более мелких

микробов.

При микроскопии иммерсионным объективом

х90 обязательным условием является его погружение в кедровое, персиковое или при их отсутствии в вазелиновое масло, показатели преломления света у которых близки предметному стеклу, на котором делают препараты (мазки). В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив. Разрешающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм, а максимальное увеличение объекта достигаем 1350.

При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Если тубус микроскопа раздвижной, его устанавливают на длину 160 мм, затем поднимают конденсор до уровня предметного столика, открывают диафрагму, устанавливают объектив х8 и при помощи плоского зеркала освещают поле зрения. На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят каплю масла, в которую под контролем глаза осторожно погружают объектив, затем, поднимая тубус, смотрят в окуляр и вначале макро-, а потом микровинтом устанавливают четкое изображение объекта. По окончании работы поднимают тубус, снимают препарат, салфеткой удаляют масло с фронтальной линзы объектива, отводят его в сторону и опус кают к предметному столику.

Темнопольная микроскопия.Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Это достигается с помощью пара­болоид- или кардиоид-конденсора, который заменяет обычный конденсор в биологическом микроскопе.

Фазово-контрастная микроскопия.Основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превра­щаются в амплитудные и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной илинегативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негатив ным фазовым контрастом — светлое изображение объекта на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособле­ние КФ-1 или КФ4.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия.Основана на явлении фотолюминесценции. Первичная (собственная) люминесценция наблюдает­ся без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специаль­ными люминесцирующими красителями — флюорохромами. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследова­ния живых микроорганизмов и обнаружения их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности.

В лабораторной практике люминесцентная микроскопия широко применяется для выявления и изучения многих микроорганизмов.

3. Типы микроскопических препаратов. Этапы приготовления фиксированного мазка. Простые мето­ды окраски.

В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов: а) бактериологический мазок (препарат-мазок); б) «висячая капля»; в) «придавленная капля»; г) тонкий мазок; д)»толстая капля»; ж) препарат-отпечаток.

Необходимые для исследования материалы

Для изучения анализов по бактериоскопическому методу необходимы следующие инструменты:

1. Металлическая петля.
2. Предметное стекло. Этот предмет обязательно должен быть чист, так как любое его загрязнение может повлиять на состояние образца.
3. Пинцет.
4. Фильтровальная бумага.

Очистка новых предметных стекол производится с помощью 1%-ного раствора соды. После кипячения в таком растворе стекло промывается дистиллированной водой, слабым раствором соляной кислоты, а затем снова дистиллированной водой. Бывшие в употреблении стекла очищаются в несколько этапов: сначала их помещают в раствор серной кислоты на 60-120 минут, затем кипятят в растворе соды, после чего производится промывка стекла водой. После этого стекло опускают в медицинский спирт.

Хранить приборные стекла нужно либо в спирте, либо в плотно закрытых емкостях. Причем в последнем случае стекла должны быть сухими.

Для данного исследования также понадобятся следующие химические реактивы:

• Спирт;
• Раствор Люголя;
• Красители.

Наиболее часто используемыми красителями являются фуксин Циля, метиленовый синий и карболовый генцианвиолет. Последний краситель представляет из себя раствор обычного фуксина в пятипроцентной карболовой воде

Ход исследования

Исследовать культуру можно как в первозданном, так и в окрашенном виде. В последнем случае как колонии микроорганизмов, так и одиночные бактерии будут мертвы, что позволяет лучше ознакомиться со строением этих простейших организмов. При исследовании препарата в его первозданном виде, в свою очередь, лаборант получает больше информации об активности микробов. В обоих случаях препарат рассматривается при помощи микроскопа.

Рекомендуем почитать! Перейдите по ссылке: Что такое ЖЕЛ (жизненная ёмкость легких)

Окрашивание среды проводится в два этапа, сначала препарат подготавливают к процедуре и только затем его окрашивают. Подготовка образца проходит следующим образом:

1. Образец, предназначенный для исследования, равномерно распределяется по приборному стеклу в форме круга или овала. При наличии в материале посторонних примесей (к примеру, гноя) перед добавлением исследуемого образца на стекло наносится 1-2 капли воды.
2. После этого получившийся мазок следует высушить.
3. Как только мазок высохнет, его необходимо зафиксировать с помощью пламени из горелки.

Для фиксации таким образом приборное стекло трижды проводится над пламенем. Если мазок зафиксирован достаточно прочно, то лаборант, проводящий эксперимент, почувствует жжение в пальцах.

По окончании данной процедуры проводится окрашивание образца.

Методы окраски образца

Окрашивание может быть простым, с использованием одного красителя. И сложным, при котором с целью точной дифференциации клеток бактерий по тем или иным их характерным признакам последовательно наносятся на образец несколько различных окрашивающих химических реагентов. Примером сложного окрашивания может служить методы Грама и Циля-Нильсена.

Метод Грама

Метод Грама позволяет определить химический состав клеточной мембраны. Благодаря этому методу была введена классификация бактерий по Граму: грамположительные бактерии (к которым относятся возбудители многих болезней) после окраски приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – характерный красный оттенок. Метод Грама состоит из следующих этапов:

1. Сначала препарат обрабатывают раствором Люголя на протяжении одной минуты.
2. После обработки люголем образец обесцвечивают с помощью спирта.
3. Затем препарат промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают фуксином.

Метод Циля-Нильсена

Метод Циля-Нильсена применяется для определения кислоточувствительных бактерий, в клеточных мембранах которых содержится большое количество липидов, к примеру, возбудителей туберкулеза. Работа по данному методу проводится в пять этапов:

1. На предметное стекло накладывают фильтровальную бумагу, на которую затем наносят небольшое количество фуксина Циля.
2. Затем предметное стекло нагревают до появления характерного пара. После появления пара стеклу дают остыть. Данную процедуру повторяют еще два раза, после чего снова дают остыть стеклу.
3. После этого дистиллированной водой смывают фуксин с приборного стекла, предварительно убрав бумагу.
4. Затем стекло помещают в раствор соляной или серной кислоты до полной утраты образцом цвета.
5. Наконец, на обесцвеченный препарат наносят раствор метиленового синего, стекло промывают дистиллированной водой и дают ему высохнуть для дальнейшего рассмотрения получившегося препарата под микроскопом.

Рекомендуем почитать! Перейдите по ссылке: Зачем делают туберкулиновую пробу

Метод Леффлера

В число простых методов окрашивания входит метод Леффлера. При нем все бактерии приобретают синий цвет. Работа по данному методу проводится в два шага:

1. На мазок кладется фильтровальная бумага, на которую наносится раствор метиленового синего Леффлера. В таком состоянии препарат оставляется на 3-5 минут.
2. По прошествии данного промежутка времени препарат промывается водой и высушивается, после чего его можно исследовать под микроскопом.

При бактериоскопическом методе окрашиваются как минимум два препарата, причем один из них окрашивается простым методом, а один – сложным.

Бактериоскопический метод (мазок на инфекции)

Мазок (бактериоскопический метод) — самый распространенный метод лабораторной диагностики.

При бактериоскопическом методе анализ выполняется с помощью светового микроскопа. Исследуемый материал вносят в каплю физраствора, тщательно размешивают и распределяют по стеклу. Должно наступить хорошее окрашивание частей клеток и бактерий в разные цвета, чтобы оценить состав выделений из уретры, влагалища и шейки матки.

Анализ соскоба из уретры или влагалища в гинекологии позволяет определить: — количество лейкоцитов (их повышение говорит об инфекции, но у здоровых женщин небольшое число лейкоцитов присутствует во флоре); — количество эритроцитов (основной показатель воспалительного процесса при повышенном количестве); -состав флоры (у женщин он зависит от менструального цикла, но активность клеток говорит о нарушении микрофлоры); — наличие трихомонады, гонококков, грибка – основная цель для выявления возбудителя инфекций; — наличие лактобацилл (их отсутствие говорит о нарушенной микрофлоре). Также мазок определяет степень чистоты влагалища женщины: 1 и 2 степень – характерна для здоровой флоры, а 3 и 4 – выявляет кольпит, воспаление.

Преимущества данного метода состоят в простоте, доступности и быстроте получения результатов (30 — 60 мин и менее). Однако чувствительность данного метода ограничена (около 105 бактерий в 1 мл). Практически не определяются в урогенитальном мазке вирусы, хламидии, микоплазмы и уреаплазмы, и одних только результатов мазка часто бывает недостаточно для постановки диагноза. Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. Результаты мазка обычно можно использовать как ориентировочные.

Перед сдачей мазка лучше воздержаться от мочеиспускания.

Бактериологический метод

Зачастую при исследовании анализов возникает необходимость определить чувствительность патогена к тому или иному препарату. В этом случае проводится исследование образца по бактериологическому методу. Данный способ состоит из следующих этапов:

• Сперва необходимо очистить культуру с целью выявить конкретные виды микробов. Для этого образец нужно поместить в среду, в которой развитие бактерий, которые нужно выявить, наиболее вероятно. Также возможно механическое разделение биоматериала при его посеве.
• После получения чистой культуры, взятые из нее образцы исследуются с помощью бактериоскопического метода.

Ниже приведены примеры сред, используемые для выявления микроорганизмов:

• Среда Эльшнига, состоящая из одной трети лошадиной сыворотки и двух третей бульона.
• Сыворотка Леффлера, которая используется для выявления возбудителей дифтерии. Такая среда состоит из трех четвертых сыворотки лошадиной или бычьей крови и одной четвертой бульона с содержанием 1% глюкозы.
• Кровяной агар, используемый для выявления стрептококков и проверки их чувствительности к воздействию антибактериальных препаратов. Данная среда состоит из 5-10% сыворотки крови животных и агара.

Бактериологический метод (бакпосев)

Бакпосев – метод диагностики ЗППП путем выращивания микробов в благоприятной для этого среде. Он является золотым стандартом в определении инфекций, поскольку выявляет не только вирус, но и его активность. Преимуществом данного метода является возможность не только выявить бактерию, но и возможность получить антибиотикограмму, на основе которой врач назначает точное лечение. Наиболее часто бакпосев используют для диагностики уреаплазмоза, микопламзоза, трихомониаза, хламидиоза, различных форм кандидоза.

Правила сдачи анализа на бакпосев:

• за сутки не спринцеваться, не пользоваться вагинальными свечами;
• за сутки до анализа воздержаться от половых контактов;
• за неделю прекратить прием антибиотиков;
• не опорожнять мочевой пузырь за 1,5-2 часа.

Виды бактериоскопии анализов

Бактериоскопия анализов кала

Для бактериоскопического исследования анализа кала необходим образец анализа пациента. Если необходимо провести анализ микрофлоры кишечника, нарушения в составе которой свидетельствуют о наличии дисбактериоза или инфекционных заболеваний пищеварительной системы, забор образца проводится с помощью петли, которая вводится в анальное отверстие примерно на 10 сантиметров вглубь.

При исследовании образца кала могут быть обнаружены следующие опасные микроорганизмы:

• Стафилококки.
• Клебсиелла, наличие которой свидетельствует о поражении толстой кишки.
• Синегнойная палочка, выделяющая крайне опасные для человека токсины.

Рекомендуем почитать! Перейдите по ссылке: Что такое ПЦР анализ на туберкулез

Наличие синегнойной палочки в организме человека может привести к заражению крови и менингиту – заболеваниям, которые могут иметь летальный исход.

Бактериоскопия анализов мочи

Анализ мочи для бактериоскопического исследования сдается при подозрении на воспаление мочевыделительной системы и наличие таких болезней, как пиелонефрит и цистит, возбудителями которых являются кишечная палочка и некоторыми возбудителями заболеваний, передающихся половым путем, соответственно. Для такого исследования необходимо от 50 до 100 мл мочи, причем моча должна храниться в стерильном контейнере. Перед сдачей анализа необходимо хорошо подмыться, чтобы в моче было меньше сторонних примесей. Не рекомендуется сдавать мочу во время менструации.

Бактериоскопический анализ мочи незаменим для обнаружения заболеваний мочевыделительной системы у грудных детей. В этом случае моча собирается через катетер в стерильную емкость. Исследование образца мочи необходимо провести в кратчайшие сроки, иначе обнаружение возбудителей заболеваний будет затруднено.

Бактериоскопия мокроты

При анализе мокроты исследуются два мазка. Один из них изучается на предмет наличия палочек Коха – возбудителей туберкулеза. По результатам исследования второго делаются выводы о наличии в мокроте других микробов.

Для анализа мокроты на туберкулез проводится окрашивание образца по методу Циля-Нильсена.

Для анализа на предмет наличия других микробов образец окрашивают по методу Грама. С помощью бактериоскопического метода с применением окрашивания по методу Грама возможно выявление пневмококка – бактерии, являющейся причиной пневмонии. Также при работе с образцом по такой схеме можно выявить наличие в мокроте стрептококков – возбудителей ангины, а также золотистого стафилококка. Последний микроорганизм представляет особую опасность для здоровья человека. Он провоцирует гнойные процессы и образование абсцессов, в том числе и на внутренних органах.

ИФА

Иммуноферментный анализ нацелен на выявление антител в крови. Соответственно, чем больше титр, тем больше антител к тому или иному инфекционному заболеванию. IgG – антитела говорят о перенесенном в прошлом инфекционном заболевании, а IgМ – антитела говорят о наличии острого инфекционного процесса. ИФА позволяет диагностировать:

• вирусные инфекций: гепатиты, ВИЧ-инфекции, вирус герпеса, краснухи, цитомегаловирус;
• бактериальные инфекции: туберкулез, боррелиоз, сифилис;
• иные болезни: лямблиоз и токсоплазмоз.

Такой анализ крови необходим, чтобы определить стадию заболевания, оценить эффективность лечения, получить информацию о перенесенном ранее заболевании.

Подведем итоги

Бактериоскопический метод диагностики является одним из основных методов исследования в микробиологии. Несмотря на его недостатки, данный метод широко применяется в современной медицине для диагностики самых разных заболеваний, некоторые из которых, к примеру, туберкулез, представляют особую опасность для человека.

Если вас заинтересовала тема этой статьи или у вас есть чем ее дополнить, оставьте свой комментарий. Если вам понравилась данная статья или вы просто интересуетесь микробиологией, вы можете поделиться ей в социальных сетях.