Лейкоцитарная формула (с обязательной микроскопией мазка крови)

Микроскопические особенности

При появлении токсической зернистости, внешний вид нейтрофилов изменяется, что хорошо видно в электронном микроскопе.

Морфологические признаки нейтрофила при ТЗН:

1. В 2-3 раза больше зрелого эритроцита
2. Низкое отношение ядра к цитоплазме (больше цитоплазмы, чем ядра)
3. Ядро зрелое и разделено на 3-5 долей, соединенных тонкими нитями хроматина
4. Нуклеолы отсутствуют
5. Более темные (красные / фиолетовые) гранулы легко заметны (аналогично первичным гранулам, отмеченным в промиелоцитах)

Появление грубой зернистости в цитоплазме

Если сравнить токсически измененную клетку с нормальной, то выявится одно существенное отличие — рядом с обычными гранулами нейтрофилов появляется токсическая зернистость, которая выглядит в виде более крупных округлых образований темно-красного и фиолетового цвета. Появление дополнительных гранул в нейтрофилах обусловлено коагуляцией (склеиванием) белка цитоплазмы, что под микроскопом выглядит как появление дополнительной зернистости на фоне уже имеющихся гранул.

Обнаружение патогенной зернистости

Для обнаружения такого нарушения применяется Фуксин и метиленовый синий. Препарат Фуксина готовится так:

1. На 15 г этанола (96-процентного) берется 1 грамм красителя и растворяется (с помощью нагревания).
2. Затем добавляется 100 граммов 5-процентного раствора карболки.
3. Потом 7 капель полученного раствора добавляется в 20 мл воды. В нее добавляется 5 капель 1-процентного препарата метиленового синего. Смесь тщательно разбавляют. Потом ею окрашивают мазки (на протяжении одного часа), смывают и просушивают. После возможно увидеть зернистость (пыль, хлопья).

Причины токсигенной зернистости

Уже из названия становится понятно, что зернистость нейтрофилов имеет токсическую причину своего появления. Причем интоксикация в этом случае может быть не только инфекционной природы.

Наиболее частые причины токсической зернистости нейтрофилов:

1. Сепсис
2. Перитонит
3. Обширные гнойные процессы, флегмоны
4. Крупозная пневмония
5. Казеозная пневмония и другие обширные формы туберкулеза
6. Грипп, ОРВИ с тяжелым течением
7. Распад опухоли
8. Скарлатина
9. Флегмона
10. Гангренозный аппендицит
11. Облучение (лучевая терапия или радиация)
12. Химиотерапия
13. Отравление
14. Тяжелое течение коронавирусной инфекции, в том числе Covid-19 (SARS-CoV-2)

Лейкоцитарная формула (с обязательной микроскопией мазка крови)

Лейкоцитарная формула (с обязательной микроскопией мазка крови) – подсчет количества общего количества и разных видов лейкоцитов, а также изучение их морфологических особенностей посредством микроскопии мазка периферической крови.

Синонимы русские

Лейкоформула.

Синонимы английские

Leukocyte Differential Count, WBC Count Differential, Diff, Blood Differential, Differential Blood Count, White Blood Cell Differential.

Метод исследования

Проточная цитофлуориметрия.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную, капиллярную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Исключить из рациона алкоголь в течение 24 часов до исследования.
• Детям в возрасте до 1 года не принимать пищу в течение 30-40 минут до исследования.
• Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.
• Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение в течение 30 минут до исследования.
• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Лейкоциты — это гетерогенная популяция ядросодержащих клеток крови, которые являются важнейшей частью иммунной системы человека и играют роль в процессах воспаления, аллергии и противоопухолевой защиты. Выделяют пять типов лейкоцитов, каждый из которых выполняет свои специфические функции: три вида гранулоцитов (эозинофилы, базофилы, нейтрофилы), моноциты и лимфоциты. Изучение лейкоцитарной формулы в мазке периферической крови представляет собой подсчет количества разных видов лейкоцитов и оценку их морфологических свойств. Для исследования может использоваться как венозная, так и капиллярная кровь.

Окраска мазка крови специальными красителями позволяет различать клетки и внутриклеточные структуры, кроме того, разные виды лейкоцитов неодинаково восприимчивы к некоторым красителям и окрашиваются по-разному, что вместе с различиями в их морфологических свойствах (форма ядра, размеры и наличие внутриклеточных гранул) позволяет дифференцировать основные виды лейкоцитов при изучении мазка с помощью микроскопа. Традиционно подсчет проводят на сто клеток и полученные цифры записывают в процентах. Зная общее количество лейкоцитов, проценты можно пересчитать в абсолютные значения, которые гораздо более объективно отражают состояние лейкоцитарной популяции.

Гранулоциты называются так потому, что содержат в своей цитоплазме гранулы, в которых содержатся биологически активные вещества, необходимые для выполнения лейкоцитами своих защитных функций. Выделяют три типа гранулоцитов:

• Зрелые нейтрофилы имеют сегментированное на 4-5 долек ядро и гранулы, которое при окраске по Романовскому — Гимзе окрашиваются в фиолетовый цвет. Сегментоядерные нейтрофилы составляют основную часть лейкоцитов периферической крови. В намного меньшем количестве в крови могут встречаться нейтрофилы предыдущей стадии созревания – палочкоядерные (с ещё не разделенным на дольки ядром). Клетки более ранних этапов созревания (метамиелоциты, миелоциты и другие) могут появляться в мазке крови в исключительных случаях – например, при тяжелых инфекционных заболеваниях, когда костный мозг выбрасывает на борьбу с инфекцией еще не созревшие клетки (это называется сдвигом лейкоцитарной формулы влево), а также при хроническом миелолейкозе.
• Эозинофилы участвуют в противопаразитарном иммунитете и развитии аллергических реакций. В их гранулах, которые окрашиваются в оранжево-розовый цвет, содержатся медиаторы аллергии и воспаления. Эозинофилы отличаются от нейтрофилов также по строению ядра — оно у них двудольчатое.
• Базофилы – гранулоциты, которые принимают активное участие в аллергических реакциях немедленного типа. Они имеют S-образное несегментированное ядро, которое нередко не видно из-за крупных гранул интенсивного синего цвета, содержащих медиаторы аллергии.
• Лимфоциты – клетки с крупным ядром, практически лишенные цитоплазмы. При окраске по Романовскому — Гимзе их ядро окрашивается в интенсивный пурпурно-фиолетовый цвет, а цитоплазма в сине-голубой. Лимфоциты участвуют в более сложных реакциях иммунитета, связанных с узнаванием своих и чужих антигенов, выработкой антител. Существует три класса лимфоцитов: Т-лимфоциты, В-лимфоциты и NK-клетки («натуральные киллеры»), однако стандартная окраска не позволяет их различать, для этого используются более сложные в техническом отношении методы (например, иммунофенотипирование).
• Моноциты – относительно крупные лейкоциты, содержащие несегментированное бобовидное ядро и, в отличие от лимфоцитов, большое количество цитоплазмы. Ядро при окраске по Романовскому — Гимзе приобретает пурпурно-красный цвет, а цитоплазма – мутный голубовато-серый. Основная функция моноцитов – фагоцитоз, то есть поглощение и переваривание микроорганизмов, собственных отмирающих клеток и т.п.

Вышеперечисленные типы лейкоцитов встречаются в мазке периферической крови в норме. При некоторых заболевания в кровь из костного мозга могут выходить клетки, которых в норме в мазке быть не должно: например, бласты – морфологический субстрат острого лейкоза. В заключении к исследованию обязательно указывается количество и по возможности морфологические особенности атипичных клеток.

Помимо подсчета количества клеток, врач лабораторной диагностики при микроскопии мазка крови отмечает изменения морфологии лейкоцитов:

• Токсогенная зернистость нейтрофилов – внутри клеток присутствуют темные крупные грубые гранулы, которые образуются в результате коагуляции («сваривания») белка цитоплазмы под влиянием продуктов интоксикации.
• Вакуолизация цитоплазмы – также обусловлена тяжелой интоксикацией, под влиянием которой в клетке возникает жировая дистрофия, а при фиксации мазка спиртом капельки жира растворяются и клетки приобретают характерный вид.
• Тельца Князькова — Деле – крупные бледно-голубые участки цитоплазмы нейтрофилов, свободные от специфических гранул. Также встречаются при воспалительных заболеваниях, сепсисе.
• Гиперсегментация ядер нейтрофилов – более пяти сегментов в ядре сегментоядерного нейтрофила. Может быть врождённой особенностью (в таком случае не имеет клинического значения), а следствием дефицита витамина В12 или фолиевой кислоты.
• Аномалия лейкоцитов Пельгера – врождённое нарушение созревания нейтрофилов, проявляющееся уменьшением сегментации их ядер. Зрелые нейтрофилы содержат несегментированное или двухсегментное ядро. Это не сопровождается нарушением физиологических свойств нейтрофилов.
• Тени Боткина — Гумпрехта – полуразрушенные ядра лейкоцитов с остатками ядрышек, получаются в процессе приготовления мазка из опухолевых клеток при хроническом лимфолейкозе.

Для чего используется исследование?

• Для определения количества отдельных видов лейкоцитов и их соотношения между собой, оценки морфологических признаков лейкоцитов.

Когда назначается исследование?

• При подозрении на инфекционное заболевание, а также на патологию костномозгового кроветворения.
• При отклонениях количества лейкоцитов от референсных пределов по данным исследования крови, выполненного на гематологическом анализаторе.

Что означают результаты?

Референсные значения

Лейкоциты

Нейтрофилы

Лимфоциты

Моноциты

Эозинофилы

Базофилы: 0 — 0,8 *10^9/л.

Микроскопия мазка крови

Нейтрофилы — палочк.: 0 — 5 %.

Нейтрофилы — сегмент.

Лимфоциты, %

Моноциты, %

Эозинофилы, %

Базофилы, %: 0 — 1 %.

Повышенный уровень нейтрофилов может наблюдаться при острых бактериальных инфекциях, интоксикациях и миелопролиферативных заболеваниях.

Нейтропения может быть обусловлена тяжело протекающей инфекцией, сепсисом, токсическим воздействием на костный мозг (цитостатики, ионизирующее излучение, миелотоксические лекарственные препараты), апластической анемией, а также врождёнными заболеваниями (нейтропения Костманна, циклическая нейтропения).

Наиболее частыми причинами эозинофилии являются аллергические заболевания, паразитарные инфекции, миелопролиферативные заболевания.

Повышение базофилов может свидетельствовать об аллергических реакциях или миелопролиферативных заболеваниях.

Абсолютный лимфоцитоз встречается при вирусных инфекциях, в том числе инфекционном мононуклеозе и цитомегаловирусной инфекции, хроническом лимфолейкозе.

К снижению количества лимфоцитов могут приводить длительный прием глюкокортикостероидов, тяжелые вирусные заболевания, врождённые и приобретенные иммунодефициты, злокачественные новообразования.

Моноцитоз возможен при инфекциях, гранулематозных заболеваниях (туберкулез, бруцеллез, саркоидоз), опухолях крови, системных заболеваниях соединительной ткани.



Важные замечания

• Повышение или снижение процентного содержания какого-либо вида лейкоцитов называется относительным и не всегда соответствует изменению абсолютного значения.

Также рекомендуется

• Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с обязательной микроскопией мазка крови)

Кто назначает исследование?

Гематолог, терапевт, педиатр, врач общей практики, инфекционист, онколог.

Литература

1. Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 23e by Richard A. McPherson MD MSc (Author), Matthew R. Pincus MD PhD (Author). St. Louis, Missouri : Elsevier, 2021. Pages 527-531.
2. A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests, 9th Edition, by Frances Fischbach, Marshall B. Dunning III. Wolters Kluwer Health, 2015. Pages 67-82.
3. Руководство по лабораторным методам диагностики / Кишкун А. А. Москва: ГЭОТАР-Мед, 2007. С. 44-60.

ТЗН при Ковид-19 и гриппе

Токсическая зернистость нейтрофилов для вирусных инфекций менее характерна, чем для бактериальных, что обусловленно несколько иным иммунным ответом.

Но тем не менее, при тяжелом течении таких вирусных заболеваний, как грипп и коронавирусная инфекция, ТЗН в анализе крови встречается довольно часто. Связано это с тем, что из-за снижения иммунитета на фоне тяжелого протекания вирусной инфекции, зачастую присоединяется и бактериальная инфекция в виде пневмонии или генерализованной бактериальной инфекции, что и приводит к появлению токсогенной зернистости.

Диагностика

Токсическую зернистость не всегда можно обнаружить при обычном окрашивании, поэтому для ее выявления применяются специальные методы, а именно метод окрашивания Фрейфельд. В этом случае применяют фуксин и раствор метиленового синего.

Для приготовления первого красителя один грамм фуксина помещают в 96% этиловый спирт (15 грамм) и нагревают до растворения. После того как остынет, добавляют 5% раствор карболовой кислоты в количестве 100 мл. Семь капель первого красителя добавляют в 20 мл воды и перемешивают, затем добавляют второй краситель (1% раствор синего метиленового) в количестве пяти капель и снова перемешивают.

После окрашивания можно наблюдать сиреневую зернистость в виде пыли или хлопьев, что зависит от тяжести заболевания. В результате анализа обычно указывают размер гранул, то есть зернистость может быть пылевидной, мелкой, средней, крупной, в виде хлопьев, и количество нейтрофилов (на сто клеток) с токсогенной зернистостью в процентах.

Кроме этого, при диагностике нужно:

• рассчитать лейкоцитарную формулу;
• выявить общее число лейкоцитов;
• установить, имеют ли лейкоциты патологические изменения;
• определить уровень юных форм нейтрофилов.

На что влияет

Независимо от причины появления в нейтрофилах токсогенной зернистости, снижается их фагоцитарная активность, хемотаксис (движение в сторону инфекции) и способность убивать бактерии лизосомальными ферментами. В целом, нейтрофилы становятся менее активными, снижается их способность выполнять свои функции. Даже если количество нейтрофилов в норме или повышено в соответствии с инфекционным процессом, то иммунная защита нейтрофилов, в том числе и фагоцитоз, все равно оказывается снижена.

Появление в анализе крови и нарастание степени ТЗН — это неплагоприятный сигнал при любом заболевании и патологическом состоянии.

Обозначение в распечатке анализа

Токсическая зернистость нейтрофилов в анализе крови обозначается следующим образом:

• Токсогенная (токсическая, токсигенная) зернистость
• ТЗН

Обозначение зернистости нейтрофилов в анализе крови

У токсического поражения нейтрофилов выделяют несколько степеней развития — в зависимости от выраженности в общем анализе крови ставят от 1 до 4 плюсов:

1. + (1+)- легкая степень. В цитоплазме 25-50% нейтрофилов определяется множественная пылевидная грануляция. Дополнительно могут определяться тельца Князькова-Деле.
2. ++ (2+) — средняя степень. В 40-60% нейтрофилов определяется зернистость средних размеров.
3. +++ (3+) — тяжелая степень. 70-80% нейтрофильных гранулоцитов имеют дегенеративные изменения в цитоплазме — в основном в виде крупной грубой зернистости нейтрофилов.
4. ++++ (4+) — крайне тяжелая степень. 90-100% нейтрофильных лейкоцитов имеют грубые деструктивные изменения цитоплазмы. На этом этапе также может появиться вакуолизация цитоплазмы — еще более грозный признак, чем ТЗН.

Что такое токсическая зернистость нейтрофилов?

Важная морфологическая аномалия нейтрофилов «токсическая зернистость». Токсическое изменение нейтрофилов необязательно связано с «токсемией». Термин происходит от факта, что аномалии впервые замечены у пациентов с грамотрицательным сепсисом и эндотоксемией. Однако морфологические изменения не свидетельствует о «токсическом эффекте» бактерий на лейкоцитарные гранулоциты. Токсическая грануляция – аномалии, приобретенные при созревании нейтрофильных гранулоцитов. Ускоренное созревание происходит совместно со стимуляцией высвобождения цитокинов, которые реагируют на воспаление.

Животные, оправившиеся от повреждения костного мозга или которым вводят гематопоэтические цитокины (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), могут иметь токсическую зернистость. На стандартной гемограмме присутствие токсичных изменений указывается в анализах WBC и субъективно оцениваются как слабые, умеренные и чрезмерные.