Доброго времени дня! Очень много читателей блога спрашивают меня о новой методике диагностического тестирования на предмет хронического злоупотребления алкоголем. Речь идет об анализе крови на CDT — это определение фракции трансферрина (диагностика злоупотребления алкоголем). Что из себя представляет этот тест на хронический алкоголизм? Действительно, возможно ли диагностировать хроническое злоупотребление алкоголем посредством качественного и количественного анализа карбогидрат-дефицитного трансферрина (CDT) методом капиллярного электрофореза?
В регионе, где работаю я, анализ крови на хронический алкоголизм стали делать совсем недавно. Небольшой опыт у меня уже есть.
Новые приказы требуют определение CDT во многих случаях:
- у наркологических больных, состоящих на учете, каждые три месяца
; - при обследовании во время медосмотра для получения водительской справки:
- для ношения оружия;
- допуска к работе с наркотическими веществами.
Дело в том, что обследование это очень дорогое (по информации моих читателей от 3,5 до 6 тысячи рублей), оборудование для определения CDT, наборы реагентов и расходных материалов стоят миллионы рублей. Не в каждом регионе в бюджете найдутся такие деньги.
Но, судя по вашим вопросам, методом качественного и количественного анализа карбогидрат-дефицитного трансферрина (CDT) для тестирования на предмет хронического злоупотребления алкоголем в России начали широко пользоваться. Как правило, используются автоматические капиллярные системы Minicap или Capillarys производства Sebia и наборы реагентов к ним. Разберемся вместе?
Что это за метод – анализ крови на алкоголизм?
Наркологи утверждают, что маркер CDT позволяет на ранней стадии выявить хронический алкоголизм, включая формы скрытого или латентного алкоголизма, дифференцировать его от умеренного или эпизодического употребления алкоголя. Кроме того, он обеспечивает мониторинг эффективности проводимой терапии посредством объективного отражения ремиссии или возникновения срыва.
Для этого проводится лабораторное тестирование (скрининг) сыворотки крови для выявления и количественной оценки маркера хронического злоупотребления алкоголем – карбогидрат-дефицитного трансферрина (CDT).
Анализ карбогидрат-дефицитного трансферрина позволяет выявить употребление высоких доз алкоголя, эквивалентных 50 – 80 г (0,6 л вина, или 1,5 л пива, или 0,2 л крепких 40-градусных спиртных напитков) и более абсолютного этилового спирта в день, на протяжении недели и более.
Биологический маркер CDT является единственным маркером оценки хронической алкогольной нагрузки.
В каких случаях использовать определение CDT в сыворотке крови?
При постановке на учет больных алкоголизмом очень важно лабораторное подтверждение факта хронического употребления алкоголя (положительный результат CDT теста).
Для объективизации контроля ремиссии больного алкоголизмом и принятия решения о снятии его с учета необходимо подтверждение отсутствия фактов приема алкоголя на протяжении длительного периода времени. Стойкость ремиссии подтверждается в случае получения отрицательных результатов CDT теста в течение всего периода диспансерного учета.
Обследование на предмет хронического злоупотребления алкоголем имеет большое значение для работников, чья профессиональная деятельность сопряжена с повышенным риском для окружающих. Определение алкоголя в выдыхаемом воздухе при помощи Алкометров малоэффективно, так как обследуемый всегда может подготовиться к плановому обследованию у нарколога. Определение уровня CDT, наоборот, является более эффективным средством оценки хронического злоупотребления алкоголем, так как период полураспада маркера составляет не менее 14 — 17 дней.
Запомните, чтобы получить отрицательный результат CDT алкоголь нельзя принимать минимум две недели! Однократный прием высоких доз алкоголя не вызывает повышения этого показателя. Прием лекарственных препаратов (антидепрессантов, дисульфирама) не вызывает изменений в результате данного анализа.
Очень важно использование этого метода в подростковой наркологии. Ведь на ранних стадиях развития алкогольной зависимости ее практически невозможно диагностировать при помощи клинических признаков. Выявление же повышенного уровня CDT позволяет с высокой степенью вероятности подтвердить факт хронического злоупотребления, в том числе на стадии продрома, когда клинические проявления алкоголизма еще полностью отсутствуют, а эффективность лечебно-профилактических мероприятий максимальна.
Как преобразуется С2Н5ОН?
Основные стадии преобразования:
- всасывание;
- распределение;
- окисление.
- выделение;
Абсорбция (всасывание) начинается от приема «дозы» и продолжается до достижения пика концентрации.
В фазе окисления концентрация спирта начинает падать, т. к. под действием ферментов этанол разлагается. Благодаря алкогольдегидрогеназе он трансформируется в ацетальдегид, а тот под действием ацетальдегиддегидрогеназы разлагается до уксусной кислоты.
Экскреция (выделение) сопровождается выведением этанола с продуктами жизнедеятельности и выдыхаемым воздухом. На этой стадии от выпивавшего человека исходит стойкий характерный запах.
От уровня содержания вышеупомянутых ферментов во многом зависит длительность опьянения. Оно сохраняется до момента разложения С2Н5ОН до ацетальдегида.
Важно: Ацетальдегид является ядовитым веществом, которое наряду с обезвоживанием организма и обеспечивает неприятные ощущения, известные как «похмелье». Абстиненция продолжается до преобразования данного метаболита в уксусную кислоту.
Как проводится процедура анализа карбогидрат-дефицитного трансферрина (СDT)?
Кровь отбирается из поверхностной вены в пластиковую одноразовую пробирку с плотно завинчивающейся крышкой без антикоагулянтов. Не допускается использование пробирок с ЭДТА или цитратом. Объем образца достаточный для исследования составляет 2-4 мл. К анализу допускается сыворотка при хранении ее в условиях холодильника при температуре 2- 8°C не более 10 дней.
Данное исследование более специфично для мужчин, чем для женщин. Не рекомендуется проведение анализа у женщин в период менструации и во время беременности, а также у лиц с тяжелыми хроническими поражениями печени (цирроз, карцинома, активный хронический гепатит).
Важно! В случае несогласия освидетельствуемого с положительным результатом исследования, а также в случае получения положительного результата, количественные значения которого соответствуют «серой зоне» (1,3% ≤ CDT ≤ 1,6%), следует назначить повторное исследование со свежим образцом сыворотки через 3-4 недели.
По результатам анализа врачом психиатром-наркологом оформляется «Заключение медицинского учреждения о прохождении обследования на предмет хронического злоупотребления алкоголем».
Человечество всегда сталкивалось с проблемой злоупотребления алкоголем, она не утратила своей актуальности и в наши дни. Чрезмерное употребление алкоголя неблагоприятно воздействует на здоровье населения и имеет негативные социальные последствия. Согласно представленному в 2014 г. ВОЗ «Глобальному докладу о положении в области алкоголя и здоровья» в 2012 г. 3,3 млн смертей были обусловлены потреблением алкоголя, что составило 5,9% от всех случаев смертей в мире. Среди мужского населения 7,6 и 4% случаев смерти среди женщин были связаны с алкоголем. Злоупотребление алкоголем повышает риск возникновения более 200 болезней, включая психоневрологические расстройства, онкологические заболевания, цирроз печени и различные виды травм. По данным за 2010 г., Российская Федерация занимала 4-е место в мире по показателю потребления алкоголя на душу населения в возрасте 15 лет и старше, который составил 15,1 л/год [1—3].
Для объективной оценки и мониторинга количества и частоты потребляемого человеком алкоголя используют лабораторные маркеры употребления алкоголя, которые можно разделить на две группы — прямые и непрямые биомаркеры. К непрямым биомаркерам
относятся аспартатаминотрансфераза (AСТ), аланинаминотрансфераза (AЛТ), γ-глутамилтрансфераза (ГГТ), карбогидратдефицитный трансферрин (CDT) и средний корпускулярный объем эритроцитов (MCV) [4—6]. Эти биомаркеры образуются в результате воздействия этанола на организм человека, но их содержание может повышаться в результате развития различных патологических процессов, часто не связанных со злоупотреблением алкоголем. Наиболее точным и объективным биомаркером для лабораторной диагностики хронического злоупотребления алкоголем является CDT, специфичность и чувствительность которого составляют 92—97 и 55—90% соответственно [5]. Повышение количества CDT в крови наблюдается только спустя 2 нед после потребления алкоголя в размере 60—80 г/день в течение 7—10 дней, что обусловливает поиск более перспективных биомаркеров для своевременной диагностики злоупотребления алкоголем [7, 8].
К прямым биомаркерам
потребления алкоголя относятся метаболиты этанола — этилглюкуронид (EtG) и фосфатидилэтанол (PEth) [4]. EtG накапливается в волосах человека, поэтому данный биомаркер применяют для контроля ремиссии в течение продолжительного времени [9]. В настоящее время активно изучают биомаркер PEth. PEth является глицерофосфолипидом, который образуется в различных тканях в присутствии этанола из эндогенного фосфолипида фосфатидилхолина под действием фосфолипазы D, но накапливается только в эритроцитах. Известно 48 гомологов PEth, однако наиболее часто встречаются PEth 16:0/18:1 (38%) и PEth 16:0/18:2 (24%) [10—12].
Содержание PEth повышается даже при разовом употреблении алкоголя (tmax~8 ч) [13], при этом период его полувыведения составляет 4—10 дней [14—16]. В случаях хронического злоупотребления алкоголем PEth накапливается в крови и может быть определен в течение 28 дней после последнего приема алкоголя несмотря на то, что менее 0,5% потребленного этанола метаболизируется в PEth [17, 18]. Специфичность PEth как биомаркера составляет 100% [17, 18], а чувствительность, согласно исследованиям [17—19], — от 94 до 100%.
Необходимо отметить, что при хранении взятых на анализ проб крови при комнатной температуре или при температуре –20 °С в присутствии этанола происходит образование PEth in vitro
, чего не наблюдается в случае хранения проб при 4 °C (до 72 ч) и при температуре –80 °С [20]. В настоящее время единственным официально установленным пороговым значением для выявления злоупотребления алкоголем является 0,3 мкмоль/л (210 нг/мл) PEth в крови, а значение PEth менее 0,05 мкмоль/л (35 нг/мл) характеризует низкий уровень потребления алкоголя [21]. К сожалению, приведенные пороговые значения не основаны на данных исследований о зависимости потребления алкоголя и содержания PEth в крови [4].
Разработаны различные методики количественного определения PEth, позволяющие детектировать суммарное количество PEth или отдельные его гомологи в низких концентрациях [22]. Показано, что количественное измерение суммы PEth 16:0/18:1 и PEth 16:0/18:2 коррелирует лучше с общим содержанием PEth в крови, чем измерение каждого из гомологов в отдельности [23]. Первые методы анализа PEth заключались в проведении тонкослойной хроматографии (ТСХ) [24, 25], затем определение стали проводить методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с испарительным светорассеивающим детектором [19]. Данный метод не позволял отдельно выявить различные гомологи PEth и характеризовался низкой чувствительностью (предел определения LOQ составляет 154 нг/мл).
Многие авторы [4, 14, 23] для анализа PEth в своих исследованиях применяют метод жидкостной хроматографии — тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) с электроспрейной ионизацией. При использовании данного метода LOQ составляет 14—30 нг/мл. Метод ВЭЖХ-МС/MС позволяет идентифицировать и количественно определять отдельные гомологи PEth, однако различные модификации данного метода более чувствительны. Для анализа PEth также можно использовать метод жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией высокого разрешения [12], ВЭЖХ-МС/МС [26] и ультра-ВЭЖХ-МС/MС [27]. Данные методы отличаются высокой чувствительностью, причем минимальное значение LOQ составляет 0,7 нг/мл при проведении анализа PEth с помощью LC-ESI-HRMS.
В опубликованных сообщениях [4, 12, 14, 19, 23, 26—28] PEth выделяют из цельной или гемолизированной крови объемом от 100 до 300 мкл с помощью жидкость-жидкостной экстракции гексаном или гептаном после добавления изопропанола и внутреннего стандарта. Изопропанол добавляют для разрушения клеточных мембран эритроцитов и разрыва связей между белками и липидами, что способствует высвобождению фосфолипидов для последующей экстракции. В качестве внутреннего стандарта используют фосфатидилметанол, фосфатидилпропанол, фосфатидилбутанол и PEth 16:0/18:1, 16:0/18:2 с дейтериевой меткой. Для разделения применяют различные неполярные колонки (Luna, Hypurity, Zorbax XDB), чаще всего длиной 50 мм и диаметром 2,0—4,6 мм [29]. Детектором служат тройной квадруполь (QQQ), ионная ловушка (IT) или гибридный тройной квадруполь с линейной ионной ловушкой (QTrap). Более подробно сравнительный анализ методик определения PEth представлен в таблице.
Сравнительный анализ методик определения PEth
Для ускорения анализа PEth возможно применение метода неводного капиллярного электрофореза (NACE) с использованием в качестве детектора online ESI-MS. LOQ при данной методике составляет лишь 0,4 мкмоль/л (280 нг/мл) [30]. Большинство предлагаемых методик определения PEth предполагает забор крови из вены. Для выполнения данной процедуры требуется наличие квалифицированного медицинского персонала, а сама венепункция является дорогостоящей и болезненной манипуляцией. С целью упрощения определения PEth предложен метод сухой капли крови (DBS — dried blood spots) [27, 31, 32]. В настоящее время метод успешно применяется для мониторинга ВИЧ-инфекции, употребления наркотиков и скрининга метаболических нарушений у новорожденных [33]. Преимущества данного метода заключаются в меньшей инвазивности по сравнению с венепункцией, повышенной стабильности полученных образцов и отсутствии требований клинических условий. Доказана стабильность PEth в DBS в условиях хранения при температуре –80 °C, а также при хранении в закрывающихся сумках с влагопоглощающим пакетом при комнатной температуре вплоть до 6 мес, что безусловно повышает ценность данной методики с практической точки зрения [27].
В настоящее время различные методики определения содержания PEth начали применять в лабораторно-диагностической практике для отнесения лиц к группам риска по потреблению алкоголя, мониторинга стабильности ремиссии алкоголизма и выявления возможных рецидивов. Определение количества PEth также проводят в судебной психиатрии и для допуска к вождению после лишения прав из-за управления транспортным средством в состоянии алкогольного опьянения [9].
Таким образом, из всех используемых биомаркеров для диагностики злоупотребления алкоголем наиболее перспективным представляется определение содержания PEth в крови ввиду его максимальной специфичности и высокой чувствительности. Оптимальной методикой детектирования PEth можно считать ВЭЖХ-МС/МС в различных модификациях.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
1,2e-mail; 3e-mail: StigTore.
Как интерпретировать результаты анализа крови на CDT?
Важно, что Протокол исследования должен обязательно содержать графическую кривую с изображением профилей изоформ трансферрина.
Заключение о результатах исследования без протокола качественной оценки (графика) считается недействительным.
Значение CDT больше чем 1,3 % расценивают как показатель хронического алкогольного злоупотребления (положительный результат).
Значение CDT < 1,3 % расценивают как отрицательный результат.
При получении значений в диапазоне 1,3% ≤ CDT ≤ 1,6% («серая зона») рекомендуется провести повторное исследование спустя 3-4 недели с использованием образца свежей сыворотки от этого же пациента.
