Что показывает анализ ИФА на вирус гепатита С, методы проведения и разновидности

Иммуноблот при сифилисе на Джи и М антитела — высокочувствительное, специфичное исследование. Позволяет опровергнуть/подтвердить диагноз при получении неопределенных или позитивных данных, полученных при помощи классических тестов. Отличается информативностью и 99-100% достоверностью.

Метод рекомендован как референтный (максимально точный) при необходимости выполнения дифференциальной диагностики, для подтверждения диагноза латентного сифилиса.

Лабораторная диагностика сифилиса

Серологические исследования базируются на иммунных связях, которые наблюдаются в сыворотке крови.

Белковые соединения сливаются с антигенами, в результате этого взаимодействия антигены микробов купируются.

После внедрения возбудителя (Treponema pallidum) в организме начинают вырабатываться защитные антитела.

Они атакуют микробы и предотвращают распространение болезни.

Для анализа берется кровь, добавляется в нее суспензия микробов.

Если реакция не произошла — человек здоров, произошла — болен.

Иммуноглобулины при сифилисе (иммуноглобулины к бледной трепонеме) — белки-защитники, продуцируемые для его нейтрализации.

Они выявляют инфекцию в крови, ее остатки после проведенной терапии.

Каждый из антител к Treponema pallidum имеет конкретный информативный статус, назначение и конфигурацию.

Иммуноглобулины А при сифилисе

Осуществляют контроль за местным иммунным ответом — ранней защитой, реагирующей на попадание инфекционного агента в определенный сегмент организма.

Производятся в значительной концентрации на слизистых кишечника, легких, полости рта, в незначительной — в крови.

Являются маркером активной инфекции, считаются неспецифическими, поскольку дают ответ и на другие бактерии.

Иммуноглобулины М при сифилисе

Курируют общий иммунитет.

Отличаются слабой специфичностью.

Способствуют эвакуации антигенов, предупреждают их фиксацию в тканях и запуск патологических процессов.

Их наличие указывает на активную стадию заболевания, после лечения эти белки пропадают.

Иммуноглобулины G при сифилисе

Основные иммуноглобулины вторичного иммунитета.

Обеспечивают высокую напряженность иммунного ответа в течение длительного срока.

Клетки памяти этих белков организм способен продуцировать несколько лет после приема профильных лекарственных препаратов.

Что такое ИФА?

Иммуноферментный анализ в клинике

Иммуноферментный анализ (ИФА) — лабораторное исследование основанное на высокой избирательности и специфичности иммунологических реакций “антиген-антитело”. Суть метода — выявление специфических антител с помощью специальных биохимических реакций, которые помогают определить присутствие или отсутствие антител и их количество. Есть десятки модификаций ИФА. Его применяют для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций и для определения наличия антител классов ( IgA IgM IgG) к антигенам различных возбудителей болезней. Методом ИФА можно определить уровень гормонов, иммуноглобулинов, иммунологических комплексов и других биологически активных веществ, определить антитела к любой половой инфекции. Материалом для исследования может служить кровь, спинномозговая жидкость, содержимое стекловидного тела, околоплодные воды и т.д.

В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция антигена с антителом, а присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня.

Какие инфекции можно выявить методом ИФА

В основном ИФА применяется для диагностики сифилиса (в комплексе с другими реакциями), ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов. Имеет ограниченное значение для диагностики хламидийной инфекции, цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций. Метод ИФА используется также для определения антител при различных инфекционных заболеваниях, уровня гормонов, аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний.

Определение наличия и уровня антител в крови не рекомендуется применять для первичной диагностики инфекций, передающихся половым путем. Единственное исключение — по результатам ИФА возможно распознавание сифилиса в комплексе с реакцией микропреципитации. Но наличие антител в сыворотке крови может свидетельствовать только о контакте организма с возбудителем в данное время или ранее.

Исследование наличия и уровня антител различных классов в некоторых случаях помогает определить стадию инфекционного процесса.

К сожалению, такое важное преимущество ИФА, как количественное определение антител не имеет большого значения в практической работе — т.е. не позволяет точно установить диагноз и не влияет на дозировку и сроки назначения лекарственных средств.

Преимущества ИФА относительно других методов обнаружения антигенов и антител:

Метод иммуноферментного анализа используется для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций и для определения наличия антител классов (IgA, IgM, IgG) к антигенам различных возбудителей (вирусные гепатиты, ВИЧ, сифилис, TORCH, хламидиозы, паразитозы). С помощью ИФА можно определить антитела к любой инфекции, при условии, что организм их выработал. Этот метод позволяет различать острые и хронические формы заболеваний, выделять стадию заболеваний и выявлять практически здоровых носителей и контролировать вакцинацию.

Для постановки диагноза по методу ИФА используют лабораторные тесты для идентификации возбудителя, инструментальные методы обследования и клиническую диагностику. Надо учитывать, что только по наличию тех или иных антител не может быть поставлен достоверный диагноз заболевания. Необходимо одновременно выявлять антитела к возбудителю методом ИФА и выявлять возбудителя методом ПЦР или другими методами.

ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Антинуклеарные антитела— это аутоантитела к антигенам ядра клеток. Они образуют иммунные комплексы и откладываются на базальных мембранах различных тканей и органов, тем самым вызывая воспаление и повреждение тканей и сосудов. Образование таких антител характерно для системных аутоиммунных заболеваний. Исследование на антинуклеарные антитела проводится если врача подозревает системное аутоиммунное заболевание.

Антитела к двухспиральной ДНК образуются при системных аутоиммунных поражениях соединительной ткани. Эти иммунные комплексы откладываются на тканях, стенках сосудов и вызывают их повреждение. Антитела к двухспиральной ДНК специфичны для системной красной волчанки.

Антитела к растворимым нуклеарным антигенам (ENA скрин) — скрининговый тест на антитела к растворимым ядерным антигенам — (SSA(Ro), SSB(La), Sm, RNP, Jo1, Scl70). Образуются при многих системных аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка, синдром Шегрена, склеродермия, полимиозиты, смешанное заболевание соединительной ткани, ревматоидный артрит). Положительные значения анализа являются аргументом наличия у больного аутоиммунного процесса и является показанием для дифференцированного определения титров антител к различным ENA для более точной постановки диагноза. Для дифференцированного определения антител к растворимым ядерным антигенам применяется иммуноферментный анализ -комбинированный ENA.

Антикардиолипиновые антитела IgG, IgM — это аутоантитела к отрицательно заряженным или нейтральным фосфолипидам, фосфолипидсвязывающими сывороточными белками. Антитела к фосфолипидам нарушают нормальное функционирование эндотелия кровеносных сосудов, вызывая сужение сосудов и образование сосудистых тромбов. Обследование назначают при подозрении на антифосфолипидный синдром (рецидивирующие венозные и/или артериальные тромбозы).

Качественное и полуколичественное иммуноферментное определение специфических антител класса IgG к цитрулиновому пептиду. Тест система предназначена для диагностики ревматоидного артрита различных стадий, в т.ч. начало заболевания, когда клинические проявления слабо выражены. Эффективность теста для пациентов с клинически подтвержденным ревматоидным артритом составляет от 78 до 88%.

Ревматоидный фактор обнаруживают при ревматоидном артрите, особенно при наиболее частой и распространенной форме хронического воспаления суставов, именуемой синовиит. 75-80% больных ревматоидным артритом имеют ревматоидный фактор, однако, он не специфичен для ревматоидного артрита так как обнаруживается у здоровых лиц и при ряде других заболеваний.

С реактивный белок — маркер воспалительного процесса. Использование высоко чувствительных импортных тест-систем позволяет выявлять С реактивный белок не только при высоко активном воспалительном процессе, но при хроническом и вялотекущем.

ANCA скрин— определение аутоантител к цитоплазматическим антигенам нейтрофилов (протеиназа 3, миелопероксидаза ). Анализ назначают при подозрении на системные васкулиты, гломерулонефрит.

Все перечисленные исследования доступны в лаборатории клинической иммуногенетики института

Все вышеназванные анализы и методы диагностики доступны всем, без исключения, пациентам, обратившимся в отделение лабораторной диагностики клиники.

Что такое титры иммуноглобулинов и как они падают

Титры иммуноглобулинов — термин, применяемый для определения концентраций белковых молекул.

На 4-5 сутки после заражения в крови определяются IgA.

Но вследствие того, что данный период инфекционного процесса выраженной клиники не дает, анализы на них проводятся крайне редко.

Через 7-8 суток после инфицирования клетки плазмы начинают синтезировать IgM.

Белки вырабатываются в первичном/вторичном периоде сифилиса, в третичном — ликвидируются.

Контролировать, как падает их концентрация, очень важно для оценки качества лечения.

Если на протяжении 2-3 недель после их титры снижаются медленно, можно говорить о микробиологической неэффективности назначенной терапии.

Иммуноглобулины класса G появляются спустя 35-40 дней после заражения

Через 55-60 суток их уже можно увидеть в обычных скрининговых анализах.

Когда исчезают из крови иммуноглобулины при сифилисе?

IgM продуцируются 3-4 года после подтвержденной клинической ремиссии.

У некоторых пациентов белок способен выделяться на протяжении всей жизни, что не гарантирует 100% защиты от повторного заражения.

Получение специфического комплекса на твердой фазе

После получения иммуносорбента к нему последовательно добавляют другие специфические реагенты, в результате чего на твердой фазе формируется многослойный комплекс. Природа специфических реагентов может быть разной. Определяющими моментами на этих стадиях ИФА являются специфичность реакции, характеризующаяся величиной константы связывания, и кинетика процессов.

В ИФА основной специфической реакцией является взаимодействие антигена с антителом.

Антитела, или иммуноглобулины представляют собой белки, реагирующие с антигеном, который индуцировал их образование. Они состоят из 2 пар цепей, соединенных между собой дисульфидными связями. Внутри каждой пары (легкая L и тяжелая Н) цепи между собой идентичны. В зависимости от типа Н-цепей иммуноглобулины подразделяют на 5 классов. Легкие цепи делят на 2 типа, обозначаемые κ (капа) и λ (лямбда). Оба типа L-цепей входят в состав всех 5 классов иммуноглобулинов. Такие классы как ИгГ (IgG), ИгД (IgD), ИгЕ (IgE) находятся в виде мономеров, ИгМ (IgM) встречается преимущественно в виде пентамера, а ИгА (IgA) — в виде моно-, ди- и тетрамеров. По результатам протеолиза такими ферментами, как папаин и пепсин, в иммуноглобулинах выделяют Fab- и Fc-фрагменты. Специфической активностью по отношению к антигену обладают Fab-фрагменты, Fc-участок отвечает за основные эффекторные функции антител.

Антигенами называются вещества или структуры, способные вызывать иммунный ответ. Как правило, антигены имеют многочисленные детерминанты (эпитопы); к которым специфичны активные центры Fab-фрагментов образующихся антител. Набор детерминант определяет специфичность антигена, а их число его валентность. Для антигенной специфичности белков имеет значение их конформация. Изменение конформации при денатурации белка приводит к потере некоторых детерминант. В основе взаимодействия перекрестно реагирующих антител с антигенами лежит структурное сходство с детерминантами специфического антигена.

Прочность связи Fab-фрагмента с антигенной детерминантой называется аффиностью и определяется величиной константы равновесия данной реакции. Для поликлональной сыворотки эта величина будет различной для тех молекул антител, которые являются продуктами разных В-клеток. В случае моноклональных антител такие различия исчезают. Так как антитела многовалентны (от 2 для ИгГ до 10 для ИгМ), то для характеристики прочности связывания антител с соответствующим антигеном вводят термин авидность. Она зависит от аффинности Fab-фрагментов и валентности антител.

Наряду с реакцией антиген-антитело, широкое распространение в ИФА получил белок А из-за своей способности специфически взаимодействовать с Fab-фрагментами многих иммуноглобулинов.

В последние годы широкое распространение в ИФА получила реакция между биотином и авидином (стрептавидином), позволяющая осуществлять связь между различными компонентами специфического комплекса на твердой фазе.

В ИФА используется также специфическая реакция между лектинами и углеводными остатками различных гликопротеинов.

Устранение неспецифических взаимодействий на этапе промывки

После каждого этапа инкубации специфического реагента с твердой фазой следует этап промывки. Ее цель заключается в получении моно-молекулярного слоя первого специфического реагента и устранении взаимодействий реагент — твердая фаза после инкубации последующих реагентов, а кроме того, в уменьшении количества перекрестно реагирующих антигенов со специфическим реагентом.

В результате сорбции первого специфического реагента происходит образование вначале мономолекулярного слоя на твердой фазе, а затем многослойной сорбции за счет белок-белковых взаимодействий. Добавление в промывной раствор неионных детергентов типа твин-20 позволяет осуществлять эффективную конкуренцию между белок-белковыми взаимодействиями за счет взаимодействия белок-детергент. Это же взаимодействие уменьшает сорбцию белка на твердой поверхности после частичного разрушения мономолекулярного слоя. Так как все эти процессы равновесные, то для более полного устранения многослойной сорбции необходима многократная промывка твердой фазы.

Назад

Иммуноглобулины при сифилисе: кто назначает, когда проводится анализ

Исследование назначает врач дерматовенеролог.

На анализ могут направить и другие врачи — терапевт, уролог, гинеколог, инфекционист или хирург.

Специфические антитела M появляются через одну-две недели после внедрения возбудителя в организм.

Максимальная концентрация трепонемы фиксируется на 40-60 день, пропадает — спустя 3-5 месяцев после лечебного курса, 12-18 месяцев — без бактериальной терапии.

Выявляются у лиц на первой/второй фазе сифилиса.

Позволяют установить точные сроки заражения.

IgG обнаруживаются на 25-30 сутки патологического процесса.

Их титры постоянно растут, максимальная концентрация отмечается через 2 года после инфицирования.

Особой подготовки тест не требует: перед забором крови пациенту нужно воздержаться от еды и курения 4-5 часов.

От употребления спиртосодержащих напитков — 24 часа.

Показания:

• наличие явной клинической симптоматики;
• сомнительные/положительные результаты, полученные в ходе предыдущих тестов, особенно на фоне онкологии, туберкулеза, алкоголизма, диабета в анамнезе;
• подозрение на болезнь при приеме антисептических и антибактериальных препаратов;
• врожденная форма;
• половой акт с больным человеком;
• ВИЧ-инфекция;
• выявленные венерические болезни;
• язвенные поражения гениталий;
• нейросифилис.

Интерпретация результатов иммуноблота при сифилисе

Положительный результат указывает на недавнее заражение.

Повторный (+) при проведении исследования через 1-1,5 месяца служит подтверждением диагноза сифилис.

Обнаружение IgM у новорожденных младенцев говорит о наличии сифилитической инфекции.

Поскольку плацентарная передача материнских IgM невозможна.

Отрицательный результат предполагает 2 варианта событий: инфицирования не было, анализ был проведен до выраженной реакции иммунной системы.

В сомнительных случаях через 7 дней проводится еще одно тестирование.

Критерии положительности иммуноблота:

• (+): для M — 1 четкая полоса, для G — 2 четких полосы;
• (-): для G, M — полосы отсутствуют;
• (-/+): для G — 1 четкая полоса, для M — 1 слабая полоса.

Сравнение с другими методами анализов на сифилис

В клинической практике для скринингового (предварительного) обследования на сифилис проводят исследование РМП или улучшенный вариант (РПР).

При положительных данных ставится подтверждающий трепонемный тест — ИФА, РПГА, РИТ (РИБТ), РИФ:

• РМП. Нетрепонемный экспресс-тест, определяющий антитела к трепонеме, срок выполнения — 24 часа. Реакция микропрецепитации позволяет выявить первичный и вторичный сифилис. Показанием к проведению исследования служит наличие симптомов заболевания (сыпь на кожных покровах, язвы на половых органах, увеличенные лимфоузлы). Достоверность теста составляет около 80%;
• РПР. Современный аналог классического анализа Вассермана, обнаруживает антикардиолипиновый тип антител. Реакция плазменных реагинов — модификация РМП, различие между ними заключается в технологических особенностях проведения. Достоверность РПР — 70% (первичная форма), 98% (вторичная форма);
• ИФА. Иммуноферментный тест выявляет иммуноглобулины G, M, применяется в качестве подтверждающего или предварительного анализа на сифилис. Дает позитивный результат с 8-10 недели инфицирования, помогает оценить длительность болезни у пациентов со скрытой, бессимптомной, атипичной клинической картиной, подобрать эффективную индивидуальную терапию. Достоверность ИФА составляет 97-98%;
• РПГА. Реакция пассивной гемагглютинации используется для определения сифилиса любой формы. Диагностическая ценность РПГА при ранней диагностике — 87%, на 2-3 — 98-99%;
• РИТ(РИБТ). Реакция иммобилизации Treponema pallidum базируется на процессе обездвиживания возбудителя в контакте с исследуемой сывороткой. Анализ дает позитивный результат через 3 месяца после инфицирования. Методика чувствительна, надежна, но в техническом отношении представляет определенные сложности — требует специального оборудования, долго выполняется. Достоверность составляет 100% при позднем, раннем, вторичном сифилисе, 90-93% при атипичных формах;
• РИФ. Позволяет определять антитела класса А, уступает РИТ по специфичности. Реакция иммунофлюоресценции дает (+) при латентном/вторичном сифилисе, показывает 95% достоверность при врожденном/третичном сифилисе.

Главное преимущество иммуноблота по сравнению с другими тестами заключается в том, что ответ антиген-антитело не требует дорогих технологий и зависит от массы белка.

Второй плюс — на результат не влияют отсутствие растворимости, нестабильность антигенов.

В анализе есть возможность определить реакцию иммуноглобулинов с несколькими антигенами.

Это имеет большую диагностическую ценность, особенно в сложных случаях.

Тест достаточно прост в исполнении, при необходимости позволяет выявить IgM, IgG изолированно друг от друга.

ИФА и ПЦР: просто о сложных лабораторных методах диагностики инфекций

В лабораторной диагностике существует множество методов выявления необходимого элемента в биоматериале. Для диагностики инфекционных заболеваний чаще всего используют два принципиально разных метода: ИФА и ПЦР. Мы предлагаем Вам ознакомиться с данными методами, чтоб понять плюсы и минусы каждого из них.

ИФА (иммуноферментный анализ) – это определение в крови пациента антител к инфекционным агентам. Антитела (иммуноглобулины, Ig) представляют собой белки, которые вырабатывает наша иммунная система в ответ на инфекцию. Для каждого возбудителя заболевания продуцируются сугубо индивидуальные антитела. Антитела «помечают» микробов, и по наличию таких «меток» на поверхности микробных клеток организм узнает цель для уничтожения. Антитела к одному возбудителю могут отличаться между собой по срокам появления: IgM – в острый период IgG – если процесс хронический, или в качестве постоянного иммунитета (в зависимости от вида возбудителя) IgA – при обострении хронического процесса Метод ИФА ищет «следы» реакции на вторжение инфекции, а не саму инфекцию! Из-за низкой цены и использования в качестве биоматериала крови, метод применяется в качестве скрининга. Например, при подозрении на паразитозы пациенты сдают кровь на определение антител к аскаридам, лямблиям и т.д. Если результат пришел положительным, то не стоит сразу приступать к лечению паразитов – необходимо сопоставить клиническую картину, результаты ИФА и, возможно, результаты других методов обследования. Стоит помнить, что после пройденного курса лечения антитела могут оставаться в нашем организме очень долго, даже после того, как инфекция покинула наше тело, т.е. остается, так называемый, «серологический шрам». Приведем пример: в ночном небе тысячи звезд. Многие из этих звезд уже давно погибли, но до нас до сих пор, веками, идет их свет. По сути, мы видим только след звезды. Свет есть, а звезды уже давно нет. Но если света нет, это не говорит о том, что звезды там не было. То же самое и с антителами. Их наличие не гарантирует присутствия в организме искомого инфекционного агента. Отсутствие антител не говорит о том, что инфекции нет. Если результат анализа методом ИФА положительный, то это значит, что нужно искать инфекцию более специфическими и дорогостоящими методами — ПЦР, бактериологические посевы. Возможен ложноположительный результат в случае, если несколько микробов обладают схожей антигенной структурой, тогда к разным микробам будут вырабатываться «похожие» антитела.

ПЦР – один из самых наукоемких методов. Он обнаруживает ДНК микроорганизма. Генетический материал индивидуален для любого микроба, а это значит, что метод обладает самой высокой специфичностью и не может «обознаться». Принцип ПЦР заключается в том, что в пробирке происходит многократное удвоение искомого генетического кода. В случае присутствия даже незначительного количества этого кода, произойдет увеличение его количества, и анализатор сможет «уловить» его наличие. Таким образом, ПЦР – «золотой стандарт» выявления инфекционных агентов. Однако, у этого метода есть и свои минусы. Во-первых, в отличие от ИФА, ПЦР может сказать о наличии возбудителя только в месте взятия биоматериала, которое ограничено мазком (например, с уретры или из носа). Во-вторых, за счет своей высокой чувствительности, ПЦР может обнаружить даже мертвые частицы микробов, что наблюдается сразу после лечения. В таком случае, результат будет ложноположительный.

Резюмируя вышесказанное, приведем таблицу сравнения этих двух методов друг с другом:

Внимание! Данные «классические» методы диагностики в КДЛ «ОЛИМП» модифицированы: ПЦР выполняется в Real-time режиме, вместо ИФА используют ЭХЛ, что повышает качество исследований и сводит к минимуму вероятность ложных результатов.